论著 Original Article

鲍曼不动杆菌耐药性分析及AmpC β-内酰胺酶基因研究

Published at: 2014年第34卷第1期

李艳明 1 , 刘一凡 2 , 简子娟 1 , 刘文恩 1 , 李艳华 1 , 谷秀梅 3 , 彭婉婵 1
1 中南大学 湘雅医院检验科,长沙 410008
2 中南大学 湘雅医学院检验系,长沙 410013
3 中南大学 湘雅医院检验科,长沙 410008
通讯作者 文恩 刘 Email: liuwenen@gmail.com
DOI: 10.3978/j.issn.2095-6959.10.3978/j.issn.2095-6959.2014.01.006
基金:

摘要

目的:了解临床标本分离的鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,Ab)对常见抗生素的耐药现状并研究Ab中质粒及染色体介导的AmpC β-内酰胺酶基因的分布特点。方法:应用VITEK-2微生物分析系统对中南大学湘雅医院2010年11月至2011年4月临床标本进行分离培养、鉴定和药物敏感性分析,采用PCR扩增方法对173株非重复Ab blaMOX,blaCMY-2,blaDHA,blaACC,blaACT-1,blaFOX,blaADC六种耐药基因进行分析。结果:173株临床分离菌株对第一、三代头孢菌素,青霉素,磺胺类复合制剂及呋喃妥因的耐药率均超过70%;对喹诺酮类药物中左旋氧氟沙星、环丙沙星耐药率分别为23.7%和89.0%;对氨基糖苷类抗生素耐药率为58.4%~85.5%;对氨曲南的耐药率为51.4%;对碳青霉烯类、第四代头孢菌素及β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复合物耐药率为8.7%~89.6%(其中耐药率最低的为头孢哌酮/舒巴坦)。173株Ab中携带blaADC基因的为154株(89.0%),且产blaADC基因的菌株对头孢曲松、庆大霉素、妥布霉素、复方新诺明、环丙沙星、亚胺培南的耐药率高于不产blaADC基因的菌株,两组间差异具有统计学意义(P<0.05)。未扩增出blaMOX,blaCMY-2,blaDHA,blaACC,blaACT-1,blaFOX五种耐药基因。结论:头孢哌酮/舒巴坦可作为治疗Ab感染的推荐药物。产ADC型AmpC β-内酰胺酶是Ab菌株对头孢曲松、庆大霉素、妥布霉素、复方新诺明、环丙沙星、亚胺培南耐药的重要原因之一。


Study on drug resistance and genes of AmpC β-lactamases in Acinetobacter baumannii

Abstract

Objective: To investigate the distribution and drug resistance of Acinetobacter baumannii from Xiangya Hospital and to explore the genes of AmpC β-lactamases in Acinetobacter baumannii. Methods: Acinetobacter baumannii were isolated from November 2010 to April 2011 from Xiangya Hosipital, Central South University. All strains were identified and determined the MICs of the common antibiotics by VITEK-2 System. The resisitance genes, blaMOX, blaCMY-2, blaDHA, blaACC, blaACT-1, blaFOX, blaADC were analyzed by PCR. Results: Total isolated strains were highly resistant to the first and third-generations of cephalosporin and penicillin, sulfamethoxazole, nitrofuranton (>70%). The resistance rate to quinolones, aminoglycosides, aztreonam, carbapenems/forth generations of cephalosporin/β-lactam/β-lactamase inhibitor-resistant complex was 23.7%-89.0%, 58.4%-85.5%, 51.4%, and 8.7%-89.6%, respectively. The resistance rate to cefoperazone/sulbactam was the lowest. The rate of carrying blaADC was 89.0%, and the resistance rates of blaADC-positive strains to ceftriaxone, gentamicin, tobramycin, sulfamethoxazole, ciprofloxacin, imipenem was significantly higher than that of blaADC-negative strains (P<0.05). The gene of blaMOX, blaCMY-2, blaDHA, blaACC, blaACT-1, blaFOX were not detected. Conclusion: Cefoperazone/sulbactam is recommended as treatment drugs of Acinetobacter baumannii infection. ADC type AmpC β-lactamase might be an important factor of drug resistance to ceftriaxone, gentamicin, tobramycin, sulfamethoxazole, ciprofloxacin, imipenem in Acinetobacter baumannii.

鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii,Ab)属于非发酵革兰阴性菌,为条件致病菌,是重要的医院感染病原菌[1-2]。近年来,随着临床上广谱抗生素应用的增多,其耐药性明显上升,尤其是多重耐药甚至泛耐药鲍曼不动杆菌的不断出现,在全球多个国家暴发流行并引起广泛的重视[3-4]。AmpC β-内酰胺酶存在于大多数革兰阴性杆菌中,是革兰阴性杆菌主要的耐药原因[5],它能水解青霉素、第一、二、三代头孢菌素和单环类β-内酰胺抗生素,且不被克拉维酸(CA)抑制。为了解中南大学湘雅医院Ab临床分离株对常见抗生素的耐药现状及AmpC β-内酰胺酶基因存在状况,笔者收集173株Ab进行了耐药性分析并检测质粒及染色体 AmpC β-内酰胺酶相关基因,从而了解湘雅医院院Ab的耐药现状和耐药产生的原因,为临床合理使用抗生素提供参考。

1  材料与方法

1.1  菌株来源

2010年11月至2011年4月自中南大学湘雅医院住院患者的痰液、支气管分泌物、创面分泌物等送检标本中分离出Ab 173株,菌株收集无重复。标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922,阴沟肠杆菌029M。收集上述173例Ab感染患者的临床资料,包括标本种类、年龄、住院科别等。

1.2  主要仪器与试剂

VITEK-2全自动微生物鉴定及药敏系统(法国生物梅里埃公司);PCR仪(美国ABI公司);2720基因扩增仪;Taq酶复合液(Premix Taq)(北京TIANGEN公司);DNA Marker(100~2 000 bp,大连宝生物公司);上下游引物(10 pmol/L,上海生工生物工程公司)。

1.3  菌株鉴定及药敏试验

采用VITEK-2全自动微生物鉴定及药敏系统,操作和结果判读参照美国临床实验室标准化研究所(CLSI)2010年推荐的标准。多重耐药鲍曼不动杆菌(multidrug-resistant Acinetobacter baumannii,MDRAB)判断标准参考《中国鲍曼不动杆菌感染诊治与防控专家共识》[6],是指对下列五类抗生素中至少三类抗生素耐药的菌株,包括:抗假单胞菌头孢菌素、抗假单胞菌碳青霉烯类抗生素、含有β-内酰胺酶抑制剂的复合制剂(包括哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、氨苄西林/舒巴坦)、氟喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素。

1.4  PCR检测AmpC β-内酰胺酶基因

煮沸法提取总DNA作为PCR模板,参考文献[7-8]报道,根据GenBank提供的基因序列,设计检测AmpC β-内酰胺酶基因的PCR引物(表1),并对扩增产物进行电泳。

1.5  统计学处理

对药敏结果进行统计分析,结果分析时采用两样本率比较的χ2检验,P<0.05为差异具有统计学意义。

2  结   果

2.1  药敏试验结果

纳入研究的173株Ab临床分离菌株对氨苄西林、第一代头孢菌素、半合成广谱头孢霉素药物头孢替坦、磺胺类复合制剂复方新诺明以及广谱抗生素呋喃妥因的耐药率均超过90%;对第三代头孢菌素的耐药率均超过70%;对第四代头孢菌素头孢吡肟耐药率为60.7%;对β-内酰胺/β-内酰胺酶抑制剂复合物的耐药率整体偏低,耐药率最低的药物是头孢哌酮/舒巴坦,仅为8.7%。具体见表2。

2.2  173株Ab菌株的多重耐药情况

对173株菌株的上述5类抗生素耐药情况进行了统计,其中MDRAB共33株,占19.1%(表3)。

2.3  AmpC酶基因检测

blaADC扩增产物片段大小与预期相符(图1),扩增出携带blaADC基因的154株(89.0%),未扩增出携带blaADC基因的19株(10.1%)。另未扩增出blaMOX,blaCMY-2,blaDHA,blaACC,blaACT-1,blaFOX相关基因的产物。

2.4  携带耐药基因菌株的耐药分析

在全部21种抗生素中选择代表性的15种药物,blaADC阳性菌株对头孢曲松、庆大霉素、妥布霉素、复方新诺明、环丙沙星、亚胺培南这6种药物的耐药率高于blaADC阴性菌株,且差异有统计学意义(P<0.05,表4)。MDRAB的blaADC基因携带率与非MDRAB的blaADC基因携带率差异无统计学意义[87.9% (29/33) vs 89.3%(125/140),P>0.05]。

3  讨   论

AmpC为质粒或染色体介导产生的β-内酰胺酶,属于Ambler分子结构分类法中的C类和B-J-M功能分类法中的第Ι组。Ab所产生的染色体介导的AmpC β-内酰胺酶因有别于其他AmpC酶,Hujer等[9]将其命名为ADC β-内酰胺酶。质粒型AmpC β-内酰胺酶耐药基因在质粒间及质粒与染色体间转移主要是通过转座子或整合子为工具实现的[10],多表现为多重耐药,故为临床抗感染治疗提出新的难题。

β-内酰胺类抗生素曾是Ab感染治疗的有效药物,但本研究发现Ab对多种β-内酰胺类抗菌素耐药。近年来,对碳青霉烯类的耐药率在逐年增加。2001年刘文恩等[11]的报道显示Ab在革兰阴性菌中分离率居第3位,对亚胺培南的耐药率最低,为3.4%,2006年对亚胺培南的耐药率升至11.7%[12]。本研究中blaADC阳性菌株对亚胺培南的耐药率为95.7%,blaADC阴性菌株则为63.6%,均高于其他文献报道[13-14],可能原因为本研究收集菌株数量有限,但仍提示要加强鲍曼不动杆菌对亚胺培南耐药的进一步监测,从而提供更准确的数据供临床参考。本研究中Ab对磺胺类、氨基糖苷类的耐药率均超过80%,其原因可能与抗生素滥用、院内感染有关。但是,Ab对头孢哌酮/舒巴坦的耐药率仅为8.7%,其原因可能为舒巴坦与大多数β-内酰胺类作用靶位不同,其可直接作用于细菌青霉素结合蛋白,同时它可抑制多种β-内酰胺酶,对不动杆菌有较强的抑菌作用[15],因此,含舒巴坦的β-内酰胺类复合制剂可做为治疗Ab的推荐药物[16]。另外对喹诺酮类药物中左旋氧氟沙星耐药率为23.7%,提示左旋氧氟沙星可以作为二线药物。本研究MDRAB的株数与其他文献报道[13,17]相比较低,但仍需引起高度重视。

blaADC基因的高阳性率可能与Ab对第一、二、三代头孢菌素类,青霉素类及单环类β-内酰胺抗生素的高耐药率密切相关,由于blaADC基因在Ab内普遍存在,但仍未在不动杆菌属中其他的种内以及不动杆菌以外的细菌中发现[18-19],提示检测blaADC基因有可能作为Ab特异性的鉴别指标。

blaADC基因阳性的菌株对抗生素头孢曲松、庆大霉素、妥布霉素、复方新诺明、环丙沙星、亚胺培南的耐药率与blaADC基因阴性相比差异具有统计学意义,表明染色体介导的AmpC酶在Ab对上述药物的耐药机制中起重要作用。而blaADC基因阳性的菌株对其他抗生素的耐药率与blaADC基因阴性相比差异无统计学意义,提示本组研究菌株仍可能存在其他耐药机制。MDRAB blaADC基因携带率与非MDRAB相比,差异没有统计学意义,提示blaADC基因也许并不是本研究菌株对多种抗生素耐药的主要原因,其他耐药机制可能 起主导作用。

Ab是当前医院感染的重要病原菌,应严密监测其耐药表型的发展变化,研究其耐药基因的携带情况,从而进一步深入探究导致Ab耐药的机制,以便为临床治疗提供实验室依据,对指导合理用药、控制耐药菌株的传播有重要意义。


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引用

引用本文: 艳明 李, 一凡 刘, 子娟 简, 文恩 刘, 艳华 李, 秀梅 谷, 婉婵 彭. 鲍曼不动杆菌耐药性分析及AmpC β-内酰胺酶基因研究[J]. 临床与病理杂志, 2014, 34(1): 41-46.
Cite this article as: LI Yanming, LIU Yifan, JIAN Zijuan, LIU Wenen, LI Yanhua, GU Xiumei, PENG Wanchan . Study on drug resistance and genes of AmpC β-lactamases in Acinetobacter baumannii[J]. Journal of Clinical and Pathological Research, 2014, 34(1): 41-46.